TRABAJOS

Impacto de la aplicación prolongada de urea sobre bacterias nitritantes de un Argiudol típico, Argentina

Mónica Fabiola Boccolini^1*; Laura Ana Basile²; Cristian Román Cazorla¹; Carlos Martín Galarza¹; Belén Conde¹ & Eva Lucía Margarita Figuerola³

1 Estación Experimental Agropecuaria INTA Marcos Juárez
2 Instituto de Investigaciones Biotecnológicas-Universidad Nacional de San Martin
3 Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular ‘‘Héctor Torres’’
*Autor de contacto: boccolini.monica@inta.gob.ar

Recibido: 07-07-15
Recibido con revisiones: 13-10-15
Aceptado: 15-10-15

RESUMEN

La oxidación del amoníaco a nitrito constituye un paso crítico en el ciclo del nitrógeno (N) y es realizado por las bacterias oxidantes del amoníaco (BOA) o Nitritantes. El manejo agrícola puede afectar la comunidad de las BOA a través del uso prolongado de fertilizantes nitrogenados como la urea, cuya aplicación tiende a aumentar la acidez del suelo. El tamaño, actividad, composición de las BOA y variables químicas de suelo fueron investigadas luego de 12 años de fertilizaciones con urea. El ensayo presenta un diseño en bloques completos aleatorizados con tres repeticiones sobre un suelo Argiudol típico de Marcos Juárez, Sudeste de Córdoba, Argentina. Los tratamientos fueron: A como control sin aplicación; B y C con 95 y 165 kg ha^-1 de urea como fuente de N, respectivamente. Se realizaron dos muestreos: previo a la siembra y en postcosecha de maíz. Para la caracterización de la comunidad de BOA se utilizaron los métodos del número más probable, shaken soil slurry, reacción en cadena de la polimerasa y electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante. La fertilización con urea disminuyó el pH del suelo, aumentó la abundancia y diversidad de las BOA pero no produjo cambios significativos en la actividad nitrificante potencial. La estructura de la comunidad de las bacterias nitritantes estuvo dominada por miembros del Grupo 3 de Nitrosospira en todos los tratamientos. Los resultados obtenidos indican que la fertilización con urea a largo plazo en un Argiudol típico representó una fuente de sustrato más que un factor limitante para las BOA. El efecto de la fertilización fue más evidente en el muestreo previo a la siembra de maíz.

Palabras clave: Fertilización nitrogenada; Propiedades químicas del suelo; Comunidad de bacterias oxidantes del amoníaco; Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante.

Impact of the long application of urea on bacteria nitritantes of a typical Argiudol, Argentine

ABSTRACT

Ammonia oxidation to nitrite is a critical step in the nitrogen (N) cycle and is performed by ammonia-oxidizing bacteria (AOB) also called Nitrifying. Agricultural management can affect the AOB community due to the prolonged use of nitrogen fertilizers such as urea which tend to increase soil acidity. After 12 years of urea application, size, activity, AOB composition and chemical variables were investigated. The performed field experiment had a complete randomized block design with three replicates on a typical Argiudol soil located in Marcos Juárez, Southeastern Córdoba, Argentine. The treatments were: A control without N-application; B and C with 95 and 165 kg ha^-1 of urea as the N source respectively. Soil samples were collected before sowing and after corn harvest. The AOB community was studied through the most probable number method, shaken soil slurry, polymerase chain reaction and electrophoresis in denaturing gradient gel. Urea fertilization decreased soil pH, increased AOB abundance and diversity but did not significantly affect nitrifying potential. Bacterial community structure was dominated by members of the Group 3 of Nitrosospira in all the treatments. The results showed that the long-term urea fertilization in a typical Argiudol was a substrate source and not a limiting factor for the nitrifying bacteria. The fertilization effect was more evident in the sampling date before corn sowing.

Key words: Nitrogen fertilization; Soil chemical properties; Community of ammonia-oxidizing bacteria; Denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE).

INTRODUCCIÓN

La nitrificación es el proceso final de la mineralización de la materia orgánica nitrogenada (Orozco 1999, citado en Miller Gallego, 2012) donde ocurre la oxidación biológica del amoníaco (NH₃) a nitrato (NO₃^-). Las bacterias oxidantes de amoníaco (BOA), o nitritantes son microorganismos quimioautótrofos que utilizan la oxidación de amoníaco (NH₃) a nitrito (NO₂^-) como fuente de energía, jugando un rol fundamental en el ciclo del nitrógeno (N) en suelos. La nitrificación genera el sustrato para los procesos de pérdidas de N por lavado de NO₃^- y desnitrificación (Kowalchuk & Stephen, 2001) pudiendo tener efectos negativos para el medio ambiente por ocasionar la contaminación del agua subterránea o la generación de gases de efecto invernadero.
Las BOA conforman un grupo funcional utilizado frecuentemente como modelo en ecología microbiana para estudiar el impacto de las actividades antrópicas sobre los microorganismos del suelo (Noe & Abril, 2015; Enwall et al., 2007; Kowalchuk & Stephen, 2001). Si bien las arqueas oxidantes de amoníaco (AOA) son también capaces de llevar a cabo la oxidación del NH₃, se considera que las BOA demuestran una mayor respuesta a prácticas de fertilización nitrogenada en estudios a largo plazo con respecto a las AOA (Shen et al., 2008; Ai et al., 2013).
Para caracterizar la estructura de la comunidad de bacterias nitritantes, los métodos moleculares, y en particular, el análisis por electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, en inglés DGGE, ha sido ampliamente utilizado en diferentes estudios, incluyendo suelos con manejo de fertilización (Ai et al., 2013; Enwall et al., 2007; Nicolaisen & Ramsing, 2002).
La fertilización es mundialmente utilizada para aumentar el rendimiento de los cultivos, afectando las propiedades bioquímicas y biológicas del mismo (Ai et al., 2013). En particular, el uso de fertilizantes nitrogenados puede influenciar enormemente la disponibilidad de N y el pH del suelo (Ciarlo & Palma, 2011). La magnitud del efecto acidificante por fertilización nitrogenada a largo plazo dependerá de factores como el manejo de fertilización, tipo de suelo y clima (Chien et al., 2008).
En suelos Argiudoles de la región Pampeana el elevado contenido de materia orgánica del suelo (MOS), entre 2 y 4% y la saturación de bases en el complejo, superior al 50%, permitirían atenuar el efecto acidificante de la aplicación de fertilizantes nitrogenados debido a su capacidad buffer (Iturri et al., 2010; González et al., 2011). En la zona este de la provincia de Córdoba perteneciente a la región Pampeana Ondulada domina la actividad agrícola y el manejo de fertilización depende de muchos factores, siendo el económico en términos de producción, el más importante (Lavado, 2010).
Es bien sabido que, los diferentes sistemas de labranza, la fertilización mineral y los rastrojos de cultivos afectan a la comunidad de BOA (Yu et al., 2010). Numerosos estudios a campo en diferentes suelos han estudiado el efecto de la aplicación prolongada de fertilizantes nitrogenados sobre la comunidad de las BOA y su estructura. El efecto de la aplicación de fertilizantes nitrogenados sobre el pH edáfico es determinante, debido a la implicancia de esta variable ambiental sobre la comunidad de BOA (Enwall et al., 2007; Ward, 2008; Nicol et al., 2008)
Shen et al. (2008); Yu et al. (2010) y Ai et al. (2013) observaron que en suelos de textura fina ácidos o moderadamente ácidos y de textura gruesa alcalinos, el uso de urea afectó positivamente a las BOA aumentando la abundancia y diversidad con cambios en la estructura de la comunidad. Mientras que, cuando se aplicó sulfato de amonio en suelos ligeramente ácidos, los efectos sobre dicha comunidad fueron negativos (He et al., 2007; Enwall et al., 2007).
Hasta donde alcanza nuestro conocimiento, no se han reportado trabajos que caractericen a la comunidad de bacterias nitritantes en suelos con buena capacidad buffer como los Argiudoles de la zona en estudio fertilizados con urea a largo plazo.
El objetivo de este trabajo fue caracterizar la comunidad de bacterias oxidantes del amoníaco en un ensayo de larga duración, teniendo en cuenta los efectos del manejo de fertilización sobre las propiedades químicas del suelo y rastrojos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Descripción del ensayo y diseño experimental
El trabajo se realizó en un ensayo establecido en 1993 en la Estación Experimental Agropecuaria INTA Marcos Juárez (32º 41’ de latitud Sur y a 62º 7’ longitud Oeste) ubicado sobre un suelo clasificado como un Argiudol típico de textura franco-limoso, con un 3,26% de materia orgánica (MO) y N total de 1,8 g kg^-1 de suelo. El pH es de 6,4 clasificado como ligeramente ácido (González et al., 2011); la CIC 19,3 cmol_c kg^-1 y una saturación de bases de 91% (INTA, 1978). La secuencia de cultivos usada en la rotación es maíz-trigo/soja de segunda-soja de primera bajo siembra directa continua. El diseño consistió en bloques completos aleatorizados con tres repeticiones. Los tratamientos fueron: Control, sin aplicación de urea (A); con 90 (B) y 165 (C) kg ha^-1 de N como urea por año. Además se consideró una pastura natural como situación de referencia (SR). Se realizaron dos muestreos: previo a la siembra de maíz (con rastrojo de soja1^ra. en superficie) el 18/10/2010 y en postcosecha (con rastrojo de maíz) el 27/06/2011.

Recolección y acondicionamiento de las muestras
Las muestras de suelo fueron recolectadas de 0-10 cm de profundidad con barreno 2,5 cm de diámetro tomando 30 submuestras por parcela conformando una muestra compuesta. Conjuntamente se recolectaron rastrojos con aro de 21 cm de diámetro juntando 6 submuestras por parcela para una muestra compuesta.
Las muestras de suelo húmedas fueron conservadas a 4 °C hasta su procesamiento con tamiz de 2 mm. Las determinaciones de abundancia de BOA, actividad o potencial de nitrificación de suelo (PNS), contenido de N-NO₃^- (N de nitrato) y N-NH₄⁺ (N de amoníaco) fueron realizadas en húmedo, mientras que, las determinaciones de MOS, pH, carbono (C) y N de la materia orgánica particulada (N-MOP) e incubación anaeróbica se realizaron con muestra seca. Además, se determinó el contenido de humedad gravimétrica utilizando la densidad aparente de los primeros 10 cm de suelo. La extracción de ADN genómico se realizó a partir de suelo húmedo conservado a -20 ºC y las extracciones fueron posteriormente almacenadas a la misma temperatura.
Las muestras de rastrojo fueron secadas en estufa a 60 ºC por 48 h, pesadas, molidas y almacenadas hasta las determinaciones de C y N.

Determinaciones químicas
El contenido de C y N de los rastrojos se cuantificó mediante el método de Combustión en seco (Merry & Spouncer, 1998) con analizador LECO TrusPec CN.
El contenido de MO del suelo (MOS) se estimó a partir del porcentaje de C orgánico (CO) (Gasparoni, 2008) mediante el método titulométrico (Walkley & Black (1934). Para la determinación de la MOP, se realizó el fraccionamiento por tamaño de partículas con tamiz de 106 µm según Cambardella & Elliott (1992). Se determinó el contenido de C y N de la MOP siguiendo el mismo procedimiento que para rastrojos.
Las mediciones de pH se realizaron de acuerdo a una relación suelo-agua de 1: 2,5 (IRAM, 29410. 1999). El contenido de N-NO₃^- se determinó mediante el método del ácido Fenoldisulfónico (Bremner, 1965) y el de N-NH₄+ por microdestilación directa por arrastre de vapor (Keeney, 1982).

Determinaciones microbiológicas
El N potencialmente mineralizable del suelo proviene principalmente de la fracción de MOP (Frabrizzi et al., 2003) y su estimación se realizó a través del método de Incubación anaeróbica de suelo (Echeverría et al., 2000). Dicho método propuesto por Gianello & Bremner (1986), llamado N anaeróbico (Nan) consiste en la determinación de NH₄⁺ producido luego de una incubación de suelo durante siete días a 40 °C en anaerobiosis. La cantidad de NH₄⁺ se cuantificó por microdestilación por arrastre de vapor (Keeney, 1982).
La abundancia de las BOA se estimó a través del método de recuento del número más probable (NMP) (Alexander, 1965) en medio líquido selectivo con (NH₄)₂SO₄ y CaCO₃ (Frioni, 2006). Los medios fueron incubados durante 28 días a 29ºC. La actividad enzimática se determinó a través del potencial de nitrificación de suelo (PNS) por el método Shaken Soil Slurry según (Drury et al., 2008). El contenido de NO₃^- generado en intervalos de tiempo a las 0, 2, 6, 12, 22 y 24 h se cuantificó con el método del ácido Fenoldisulfónico. La tasa de nitrificación fue determinada por regresión lineal de las concentraciones de N-NO₃^- en el tiempo (h) y la pendiente fue utilizada para determinar el PNS por día (d).

Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y electroforesis
La extracción de ADN se realizó a partir de 0,5 g de suelo con kit Fast DNA SPIN para suelo (MP Biomedicals). La calidad del ADN extraído se verificó mediante electroforesis en agarosa al 1% y la concentración mediante mediciones de absorbancia a 260 nm. Para la amplificación específica del gen 16S ARNr de las BOA se realizó una nested-PCR (Zhang et al., 2010a citado en Ai et al., 2013). En la primera amplificación se utilizaron primers específicos para las BOA, CTO F189 y R654 que amplifican una región de 465 pb (Kowalchuck et al., 1997). El producto generado fue utilizado como templado para la segunda amplificación con los primers F341-GC y R534 (Muyzer et al., 1993). Las condiciones de amplificación fueron según (Muyzer et al., 1993). Todos los productos PCR fueron chequeados en agarosa al 1% para verificar su tamaño y calidad. Posteriormente, los amplicones fueron separados por DGGE. Se prepararon geles de poliacrilamida al 8% conteniendo un gradiente lineal desnaturalizante de 35 a 60% (donde el 100% de desnaturalizante contiene urea 7M y formamida 40% v/v). Luego se sembraron 38 μL del producto de PCR por calle. Las condiciones de electroforesis fueron a 60 V durante 16 h a 60 °C. Los geles fueron teñidos con GelRed en TAE 1X durante 30 min y visualizados bajo luz UV. Los perfiles DGGE fueron digitalizados y analizados con el software Gel Compare II (Applied Maths). La posición y la intensidad de las bandas fueron utilizadas para el cálculo de diversidad de las muestras (mediante el índice de Shannon-Weaver (H’)) y análisis de conglomerados (AC).

Secuenciación y análisis filogenético
Las bandas más destacables en cuanto a la aparición e intensidad en los tratamientos en el DGGE, fueron aisladas, reamplificadas y sus productos fueron secuenciados. Las secuencias fueron comparadas con las existentes en la GenBank database del National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando el algoritmo BLAST. A partir del alineamiento se construyó un árbol filogenético con el método de Máxima Verosimilitud y el modelo de sustitución Kimura 2 (Kimura et al., 1980) del software Mega (Tamura et al., 2013). La evaluación estadística de la topología obtenida se realizó mediante un análisis de bootstrap (100 réplicas).

Análisis estadístico de los datos
Para el análisis estadístico de los datos químicos y biológicos se utilizó el programa INFOSTAT (Di Rienzo et al., 2014). Se aplicó un Modelo Lineal Mixto, tomando como efecto fijo los tratamientos de fertilización y como efectos aleatorios, las épocas de muestreo y repeticiones de campo. Cuando existieron diferencias significativas en las variables medidas se realizó la prueba de comparación de medias mediante LSD Fisher con significancias del 5%. Las correlaciones entre las variables químicas y biológicas se obtuvieron mediante el Índice de Pearson. Para garantizar la independencia de los datos, las correlaciones fueron realizadas en cada muestreo por separado. Se informan sólo aquellas consistentes en ambas fechas y estadísticamente significativas. Además, el análisis de correlación de Pearson también fue aplicado para estudiar la relación entre el pH y las bandas estudiadas. La SR no se incluyó en los análisis estadísticos.

RESULTADOS

Propiedades químicas de los rastrojos y suelo
La fertilización prolongada con urea incrementó significativamente (P<0,05) la cantidad de rastrojos y de MOS. No se detectaron diferencias (P>0,05) en la cantidad de MOP (Tabla 1). El contenido de Nan disminuyó a medida que se incrementó la cantidad de urea aplicada, siendo significativas sólo las diferencias entre el control y la dosis mayor (P<0,05). El pH del suelo también disminuyó en respuesta al agregado de fertilizante, presentando diferencias significativas entre dosis (P<0,05) (Tabla 1). Los contenidos de N-NH₄⁺ y N-NO₃^- del suelo también fueron afectados (P<0,05); el N-NH^₄+ fue 22% mayor en B con respecto al A, mientras que C no se diferenció de A y B. El contenido de N-NO^-₃ aumentó un 27% en C con respecto al tratamiento A, el que a su vez no se diferenció significativamente de B (Tabla 1).

Tabla 1. Cantidad y calidad de rastrojos de cosecha; MOP (Materia Orgánica Particulada); MOS (Materia Orgánica de Suelo); Nan (Nitrógeno anaeróbico); acidez del suelo (pH); N-NO₃^- ; N-NH₄⁺ en los tratamientos: A (Sin N); B (90 kg N ha^-1) y C (165 kg N ha^-1). SR: Situación de Referencia. Dichos valores fueron estimados por Modelo Lineal Mixto considerando a los muestreos como un factor aleatorio.
Table 1. Quantity and quality of crop residues; MOP (Particulate Organic Matter); MOS (Soil Organic Matter); Nan (anaerobic nitrogen); soil acidity (pH); N-NO₃^- and N-NH₄⁺ under treatments: A (without N); B (90 kg N ha^-1) and C (165 kg N ha^-1). SR: Reference soil. These values were estimated by linear mixed model considering the sampling as a random factor.

Letras distintas indican diferencias significativas (P< 0,05) según LSD de Fisher.
Letters refer to significant differences (P < 0,05) by Fisher LSD.

Abundancia, diversidad de la comunidad de las BOA y actividad potencial
La abundancia de BOA fue afectada significativamente (P<0,05) por la aplicación de urea, aunque no hubo diferencias entre dosis. El NMP de BOA incrementó un 12% en el tratamiento B y un 10% en tratamiento C con respecto al control A (Tabla 2). También la diversidad de BOA fue significativamente mayor (P<0,05) en los fertilizados. No obstante, el análisis del PNS indica una tendencia decreciente con la dosis de urea que no resultó significativa (P>0,05) (Tabla 2).

Tabla 2. Valores de abundancia y diversidad (H’) de BOA y potencial de nitrificación de suelo (PNS) con el error estándar en los diferentes tratamientos de fertilización y SR (Situación de Referencia).
Table 2. Abundance and diversity values (H’) of BOA and Soil Nitrification Potential (PNS) and standard error in different fertilization treatments and SR (Soil of Reference).

Letras distintas indican diferencias significativas (P< 0,05) según LSD de Fisher.
Letters refer to significant differences (P < 0,05) by Fisher LSD.

Correlaciones entre las propiedades químicas y las BOA
El análisis del coeficiente de correlación de Pearson mostró la existencia de correlaciones positivas y significativas entre H’ y el N de la MOP en ambos muestreos; detectándose una correlación con un R² = 0,75; P= 0,02 en presiembra y un R² = 0,89; P= 0,001 en postcosecha.

Estructura de la comunidad de las BOA
La estructura de la comunidad fue caracterizada por DGGE. El análisis se realizó por separado para cada muestreo ya que las muestras correspondientes fueron corridas en sendos geles. Los perfiles de banda variaron entre tratamientos en ambos muestreos. En presiembra (Fig. 1a), la fertilización provocó un aumento en la riqueza y cambios en la intensidad de las bandas del DGGE. Las bandas 2, 10 y 11 fueron exclusivas de los tratamientos con fertilización; mientras que dos bandas (8 y 14) fueron propias del control. Adicionalmente, se detectaron diferencias en la intensidad de algunas bandas entre el control y los tratamientos. Las bandas 3, 4, 12 y 16 fueron más intensas en B y C, mientras que las bandas 7 y 19 presentaron un comportamiento opuesto. El test de Pearson reveló correlaciones negativas entre la abundancia de las bandas 2 y 16 con el pH (R² = - 0,81; P= 0,004; R² = -0,76; P= 0,001, respectivamente); mientras que con la banda 19 la correlación con el pH fue positiva (R² = 0,91; P= 0,0001) indicando que a medida que disminuye el pH también lo hace esta población de BOA.

Figura 1. DGGE de BOA correspondiente al primer muestreo (presiembra de maíz) para los diferentes tratamientos de fertilización A: Sin N; B y C: con 90 y 165 kg N ha^-1 respectivamente y SR: Situación de Referencia (a); y Dendrograma de similitud (UPGMA y Coef. Correlación Pearson, expresado en porcentaje) (b). Las líneas blancas señalan las bandas secuenciadas y las fechas negras aquellas que correlacionan con el pH. Los números romanos representan las tres repeticiones de campo para cada tratamiento.
Figure 1. DGGE of BOA for the first sampling (prior to sowing of corn) with different fertilization treatments A: without N.; B and C: 90 and 165 kg N ha^-1 respectively and SR: Reference soil (a); and Dendrogram similarity (UPGMA and Correlation Coefficient of Pearson, expressed in percentage) (b). The white lines indicate the bands sequenced and black arrows indicate bands correlating with pH. Roman numerals denote the three field replicates for each treatment.

En postcosecha, se detectó menor variación en los perfiles entre los tratamientos evaluados (Fig. 2a) mostrando que la composición de la comunidad de BOA fue muy similar. Los resultados son confirmados por los dendrogramas de similitud del AC (Figs. 1b y 2b). En presiembra el tratamiento A se separó de B y C a un 85,1% de similitud. A su vez dentro de los fertilizados hubo discriminación entre dosis de fertilización. Por otra parte, en postcosecha, la estructura de las BOA presentó mayor similitud (93,5%) entre los patrones con respecto a presiembra, sin embargo, la variación estructural se mantuvo, mostrando la separación de B y C con respecto al tratamiento A.

Figura 2. DGGE de BOA correspondiente al segundo muestreo (postcosecha de maíz) para los diferentes tratamientos de fertilización A: Sin N; B y C: con 90 y 165 kg N ha^-1 respectivamente y SR: Situación de Referencia (a); y Dendrograma de similitud (UPGMA y Coef. Correlación Pearson, expresado en porcentaje) (b). Los números romanos representan las tres repeticiones de campo para cada tratamiento.
Figure 2. DGGE of BOA for the second sampling (after harvesting of corn) in different fertilization treatments A: without N.; B and C: 90 and 165 kg N ha^-1 respectively and SR: Reference soil (a); and Dendrogram similarity (UPGMA and Correlation Coefficient of Pearson, expressed in percentage) (b). Roman numerals denote the three field replicates for each treatment.

Las bandas 6, 7, 12, 14, 15, 16 y 19 fueron seleccionadas del DGGE (Fig. 1a) y secuenciadas para determinar su identidad y relaciones filogenéticas. El análisis reveló que dichas secuencias presentaron elevados porcentajes de identidad con cepas de las especies Nitrosospira tenuis, Nitrosospira multiformis mientras que dos fueron afines a secuencias de clones de β Proteobacterias oxidantes del amoníaco no cultivables (Tabla 3). Los perfiles DGGE estuvieron dominados por miembros del género Nitrosospira siendo la mayoría clasificadas como miembros del Grupo 3 de Nitrosospira (Fig. 3). No se detectaron afiliaciones filogenéticas con el género Nitrosomonas.

Tabla 3. Bandas de BOA recortadas del DGGE, secuencias conocidas de mayor similitud en el Gen Bank, porcentaje de similitud y origen de las mismas.
Table 3. AOB DGGE bands with closest matches in Gen Bank percentages of similarity, and sources of origin.

Figura 3. Árbol filogenético de las secuencias parciales del ADNr 16S de BOA, correspondientes a las bandas seleccionadas del DGGE y las secuencias con mayor similitud obtenidas de GenBank. Las secuencias correspondientes a este estudio se muestran en negrita. La escala indica % de sustituciones. Los valores bootstrap se muestran en los nodos.
Figure 3. Phylogenetic tree of partial AOB 16S rDNA sequences of DGGE selected bands in relation to 16S rDNA sequences of the closest uncultured and cultured relatives from genbank. Band sequences from this study are labeled in bold. The scale bar indicates % nucleotide substitutions. Bootstrap values are reported at the nodes.

DISCUSIÓN

La aplicación de urea a largo plazo en un suelo Argiudol típico incrementó la abundancia y diversidad de las BOA en relación al tratamiento sin fertilizar, demostrando que el N aportado es un factor preponderante como sustrato frente a la acidificación causada por la fertilización.
El pH disminuyó en los tratamientos con urea en forma similar a lo informado en otros trabajos (Fabrizzi et al., 1998; Divito et al., 2011; Wyngaard et al., 2012). Sin embargo, la abundancia, diversidad de las BOA y el potencial de nitrificación del suelo no fueron afectados negativamente por la acidificación del suelo. Esto concuerda con datos bibliográficos de suelos ligeramente ácidos y alcalinos donde se observó mayor abundancia (Biederbeck et al., 1995; Chu et al., 2008; Shen et al., 2008) o un incremento en la diversidad de BOA (Chu et al., 2007; Yu et al., 2010; Ai et al., 2013) al aplicar urea a largo plazo a pesar de la disminución en el pH edáfico.
Según Frioni (2006) el proceso de nitrificación se ve favorecido debido al elevado aporte de N por fertilización nitrogenada. En este estudio, el incremento de N aportado quedó demostrado por el mayor contenido de N-NH₄⁺ detectado en las parcelas con aplicación de urea. El mismo resultado fue observado por Chen et al. (2011) y Yu et al. (2010) en ensayos de larga duración. El aumento N mineral encontrado en los tratamientos fertilizados, podría derivar tanto del aporte del fertilizante, como así también del mayor aporte por mineralización de los rastrojos, producto del incremento en el rendimiento agrícola asociado a la fertilización (Diovisalvi et al., 2008). Según Nieder et al. (2010), además de los fertilizantes, los rastrojos de cultivos y MOS afectan la concentración de N-NH₄⁺ en la solución del suelo.
En coincidencia con estudios previos en ensayos con fertilización nitrogenada a largo plazo (Divito et al., 2011; Gregorutti et al., 2014), los tratamientos con urea generaron una disminución significativa del Nan, que representa una medida del N potencialmente mineralizable (Echeverría et al., 2000; Fabrizzi et al., 2003). Este efecto se atribuye a un aumento en la velocidad de mineralización de la MOP como consecuencia de la aplicación de N (Galantini et al., 2008). No se detectó relación entre el N potencialmente mineralizable y las BOA, pero sí se observaron correlaciones positivas y significativas entre la diversidad de BOA con el N de la MOP, indicando que posiblemente a partir de su mineralización por microorganismos heterótrofos, actuaría favoreciendo a la comunidad nitrificante.
La concentración de N-NO₃^- aumentó en los tratamientos con urea al igual que en otros trabajos de fertilización nitrogenada a largo plazo (He et al., 2007; Chu etal., 2007; Shen et al., 2008; Yu et al., 2010), pero la actividad nitrificante potencial no fue afectada. Resultados similares fueron publicados por Yu et al. (2010) al comparar suelos fertilizados con urea y un control sin fertilizar en ensayos de larga duración.
A pesar de no haberse detectado cambios significativos en el PNS, este mostró una tendencia decreciente que podría estar relacionada con la disminución del pH. La acidificación del suelo no afectó en forma negativa la abundancia y diversidad, pero es posible que haya generado una selección de especies tolerantes o acidofílicas. Ha sido demostrado que las especies de BOA capaces de crecer en condiciones ácidas poseen una ureasa intracelular que les permite tomar urea directamente del medio, superando de esta manera el inconveniente de la protonación del amoníaco a pH bajos (Burton & Prosser, 2001; Pomme-rening-Röser & Koops, 2005). Esta capacidad les permite competir exitosamente en su ambiente, sin embargo, es posible que tengan una menor velocidad de oxidación dando lugar a un menor potencial de nitrificación en condiciones in vitro. Las correlaciones observadas entre algunas poblaciones de BOA y el pH reflejarían su adaptación o la falta de competitividad frente a la acidez del suelo. En forma similar, la selección de distintos linajes de BOA a lo largo de un gradiente de pH fue observada anteriormente por Nicol et al. (2008), y podría explicarse de acuerdo a Pommerening-Röser & Koops (2005) por los diferentes pHs óptimos para el transporte de urea de las distintas poblaciones.
La sensibilidad de la comunidad de las BOA frente a la aplicación de urea fue demostrada por los dendrogramas de similitud. Dicho análisis reveló que la estructura de la comunidad de las BOA fue afectada por la fertilización en diferente magnitud de acuerdo a la época de muestreo. En presiembra, en los tratamientos fertilizados se observó un patrón de bandas más diverso con respecto al control, mientras que en postcosecha las diferencias fueron menores. Otros trabajos obtuvieron resultados similares a los observados en presiembra, donde la fertilización con urea a largo plazo aumentó no sólo la intensidad de bandas con respecto al testigo sino que además incrementó el número de bandas o riqueza en el perfil DGGE (Shen et al., 2008; Yu et al., 2010; Ai et al., 2013). A su vez en presiembra se observa una separación específica a nivel de dosis, mientras que en postcosecha la misma no es evidente. Estas diferencias entre muestreos, podrían ser explicadas por la disponibilidad diferencial de N. En presiembra las condiciones de mayor mineralización de N determinadas por el rastrojo de soja estimularían cambios más evidentes en la composición de BOA; mientras que en postcosecha la presencia de rastrojo de maíz favoreció la inmovilización de N, lo cual está asociado al cese de la actividad microbiana (Ernst, 2002). A su vez, Wright et al. (2005) observaron una fuerte influencia de especies de plantas y residuos de cosecha sobre la diversidad microbiana del suelo. Si bien el diseño de los muestreos en el presente trabajo no permite asegurarlo, sería interesante determinar si estas diferencias se deben a los rastrojos presentes en superficie o a factores climáticos o estacionales, ya que ha sido demostrado en distintos ambientes que las BOA presentan un comportamiento estacional (Taylor et al., 2012; Bouskill et al., 2011).
Las poblaciones dominantes se afiliaron filogenéticamente al Grupo 3 de Nitrosospira comúnmente detectado en ambientes terrestres principalmente en suelos agrícolas (Kowalchuck & Stephen, 2001). La detección del género Nitrosospira y la ausencia de Nitrosomonas es consistente con otras investigaciones (Kowalchuck et al., 1997; Chu et al., 2007; Yu et al., 2010) que señalan la dominancia de Nitrosospira en suelos. Más allá de que algunos trabajos han encontrado que la aplicación de fertilizantes nitrogenados a largo plazo promueve la dominancia del Grupo 3 de Nitrosospira (He et al., 2007; Yu et al., 2010), en este estudio las poblaciones afiliadas al Grupo 3 fueron detectadas también en el control sin aplicación de N. De acuerdo con lo observado por Chu et al. (2007) en tratamientos con y sin aplicación de urea a largo plazo, y por Avrahami et al. (2003) dicho grupo no necesariamente es dominante en condiciones de elevada concentración de amonio y fue encontrado tanto en suelos fertilizados como en controles sin aplicación de N.
La elevada versatilidad de las BOA pertenecientes al Grupo 3 (Avrahami et al., 2003) se ve reflejada en su ubicuidad en distintos tipos de suelos (Fierer et al. 2009 citado en Glaser et al., 2010). La presencia de poblaciones con elevada similitud a clones de Nitrosospira no cultivables obtenidos de estanques mineros (Sow et al., 2014), estaría relacionada con esta característica general de las BOA (Hiorns et al., 1995; Kowalchuck & Stephen, 2001).
Nuestros resultados demuestran que el manejo de fertilización con urea a largo plazo en un suelo Argiudol típico de la Argentina no produjo efectos negativos sobre la comunidad de BOA, las que a su vez respondieron con cambios en la abundancia y estructura demostrando su sensibilidad al manejo agrícola.

CONCLUSIONES

La fertilización nitrogenada prolongada con urea aumentó el aporte de rastrojos y MOS, pero no generó cambios en la materia orgánica particulada. No obstante, a partir de la mineralización, el N de dicha fracción podría actuar como sustrato para los microorganismos nitrificantes del suelo. La disminución del pH edáfico, no afectó negativamente a la comunidad de nitritantes. La urea representó una fuente de sustrato a partir del aporte de N, aumentando la abundancia y diversidad de las BOA. La actividad nitrificante potencial no reflejó estos cambios, sin embargo, el contenido de nitrato fue mayor en los tratamientos con aplicación. La estructura de la comunidad de BOA mostró cambios en respuesta a la fertilización y estuvo dominada por miembros del Grupo 3 de Nitrosospira.

AGRADECIMIENTOS

Los resultados presentados en este trabajo son parte de la Tesis de Maestría de la primera autora, en el Programa de Postgrado en Ciencias Agropecuarias de la Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba. La primera autora desea expresar un profundo agradecimiento a la Dra. María Basanta y Ms. Laura Torres por el asesoramiento y colaboración en la redacción de este trabajo. Este estudio fue financiado por los Proyectos Específicos AEBIO 242441 (2010-2013) y PNS 1134043 de INTA. ELMF es miembro de la carrera de investigador científico de CONICET.

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